Антитела из птиц

Сразу оговорюсь, что эта статья, и следующие по этой теме, носят околонаучный и даже развлекательный характер. Я попробую вести летопись проекта. Будет много фотографий. Может кому то будет интересно узнать про сибирских ученых Но прежде чем показывать фотографии необходимо хотя бы кратко рассказать о науке, иначе трудно будет, что-либо понять.

Об идее. Об антителах слышал, наверное, каждый. Многие знают, что антитела играют одну из центральных ролей в защите организма от инфекций. Именно препарат на основе антител (ZMapp) пытались применять для борьбы с Эбола в самом начале эпидемии. Антитела - это белки (гликопротеины) средней массы (150 кДа).

Схема строения антител

Можно заметить, что строение антитела достаточно простое.

Значение имеют три вершины этой молекулы: две, направленные вверх, Antigen-binding site (антигенсвязывающая область антитела или паратоп), и третья, направленная вниз, так называемый Fc region (константная область антитела или просто Fc регион). Подробнее про антитела можно почитать даже в википедии (ссылка).

Я же хотел бы обратить внимание на интересную особенность этих белков - антитела способны избирательно и с высокой силой взаимодействовать практически с любой заразой попадающей в наш организм.

Как им это удается? Дело в том, что паратоп (антигенсвязывающая область антитела) имеет чрезвычайно высокую вариабельность. В организме одного человека присутствует примерно 10⁹ разных вариантов антител (а точнее говоря разных вариантов антигенсвязывающей области). Из этого разнообразия обязательно найдется парочка антител, которая, исходя из теории вероятности, свяжется с патогеном.

Но на этом организм не остановится, благодаря механизму соматического мутагенеза, организму удается увеличить силу связывания и избирательность (специфичность) взаимодействия антител. Антитела не просто взаимодействуют своими антисвязывающими областями с антигеном (антиген это общее название для различных чужеродных частиц с которыми связываются антитела), они способны за счет своего Fc региона запускать различные механизмы иммунного ответа. Т.е., если антигенсвязывающая область должна быть вариабельна, то Fc регион должен быть постоянным (константным), что бы организм, который вырабатывает эти антитела, мог «спокойно» цепляться к этой области, своими рецепторами.

Надо сказать, что ученые очень быстро поняли, что такие уникальные свойства можно эффективно использовать, так как природа сама дала нам инструмент для специфического выявления различного рода инфекционных агентов (вирусы, бактерии, отдельные белки, простейшие и т.д.), которые и легли в основу серологических методов диагностики.

Для начала общие принципы. В первую очередь у нас есть некий инфекционный агент, например, вирус.

Мы вводим этот вирус животному, например, мышке, ну или мышь сама заражается вирусом. В организме мыши в ответ на появления вируса (антигена) появляются антитела. Причем из крови можно выделить фракцию белков, основными из которых будут антитела

Более того мы можем выделить подфракцию антител, которые специфически связываются с вирусом (они составляют не более 5% от всех антител). Принцип такой очистки прост. Для этого мы “пришиваем” вирус на носитель и проводим хроматографическую очистку суммарной фракции антител. В этом случае мы получаем практически чистые специфические антитела. Специфические означает, что эти антитела связываются только с вирусом, который мы использовали для введения в мышь, а с любыми другими белками они не будут взаимодействовать.

Зачем это нужно? Или по-другому этот вопрос, как это используется в диагностике? Представим ситуацию. Человек заражается вирусом. И как вы его обнаружите в человеке? Выделять вирус из крови человека, потом смотреть под микроскопом? Это хороший вариант, и он прямо дает информацию о наличие вирусных частиц в организме. Но это долго, дорого, да и многие вирусы очень похожи по внешнему виду. Например, вирус натуральной оспы, с летальностью до 90%, не отличается, в электронном микроскопе, от вируса осповакцины, которую люди используют в качестве прививки против оспы натуральной. Заражение животных и культуры клеток кровью инфицированных тоже долго, да и точность выявления вируса не велика, а разные вирусы могут вызвать сходную картину.

Можно пойти обходным путем, детектируя возбудитель не напрямую. Как уже было написано выше, наличие возбудителя в организме неизбежно вызывает наработку антител. Детектируя эти вирус-специфические антитела мы можем с высокой степенью вероятности говорить болел ли человек этим возбудителем или нет. Если антитела есть, значит, болел (болеет), если нет, значит, не болел.

Как это работает? Что бы обнаружить антитела в крови больного используют то, что вызывает их наработку – патоген (антиген). При этом необязательно использовать инфекционную форму антигена, можно использовать компоненты возбудителя, отдельные белки или «убитый» вариант возбудителя. Для анализа мы наносим интересующий нас антиген в лунки иммунологического планшета.

Потом у человека, с определенными симптомами и вероятностью заражения нашим вирусом, берем кровь и капаем в лунки (этот человек сам приходит в больницу и сдает кровь). Если в крови есть специфические антитела они «прилипают» к антигену. «Прилипают» так, что промыванием растворами его не отмоешь, зато отмываются другие, не нежные компоненты крови.

Несмотря на специфическое взаимодействие антитела с вирусом, мы по-прежнему не “видим” вирус, ведь это все происходит на лунке планшета. Что бы “проявить” картинку нам необходимо еще одно антитело, которое будет взаимодействовать уже с константной частью антитела.

Для получения таких антител используется схема аналогичная приведенной выше. Но только на этот раз животное иммунизируется не вирусом с, а антитела, или фрагмент антитела.

Как правило, для получения таких антител используют не родственные организмы. Потому что на свои собственные белки организм не будет «отвечать», он не «видит» в них чужеродности. Самые популярные организмы это кролики, козы, бараны.

Полученные антитела против антител так же можно подвергнуть хроматографической очистке.

Получается несколько парадоксальная ситуация, т.к. мы получаем антитела против антител, антитела, которые будут связываться с антителами.

К полученным антителам можно «пришить» флуоресцентную или иную метку (например фермент).

Далее меченые антитела (их еще называют вторичными) против человеческих антител мы капаем в лунку иммунологического планшета (где у нас уже комплекс антител с антигеном), они взаимодействуют с константной областью антител. Потом добавляем субстрат - «проявитель» для метки (в зависимости от метки бывают разные проявители).

После этого можно увидеть окраску либо невооруженным глазом, либо с помощью спектрофотометра при определенной длине волны.

При этом используется система положительных (антитела против возбудителя) и отрицательных контролей.

Определить наличи антител против возбудителя легко. Если они есть мы видим окрашенные лунки, если нет окраски нет.

До анализа

После анализа

То о чем я рассказал называется ИФА. Но есть и куча других приложений для антител.

Я, надеюсь, объяснил что антитела это удобный инструмент для диагностики (и науки)? Теперь собственно о проекте.

Для получения антител (поликлонального вариант) в основном используют животных, это кролики, козы, овцы и др. Но можно использовать и птиц. Причем в случае птиц не обязательно вести забор крови, антитела можно получать из желтка. В желтке яиц содержатся антитела класса Y которые могут быть с успехом использованы для тех же процедур что и антитела класса G (в животных).

Надо отметить, что эта идея не новая. На западе есть несколько компаний которые занимаются антителами из птиц. И успешно, надо сказать. В России так же есть люди занимающиеся этой темой. Я, в частности, об этом подходе узнал от сотрудников своего отдела. Но они скорее занимаются терапевтическим приложением, мне же интереснее диагностические и научные вещи.

Я в своем проекте хочу попробовать получать специфические антитела из желтка птиц.

Продолжение следует...